紫外分光光度计UV1901PC上海奥析科学仪器有限公司测酶激肽释放酶原激活剂测定法

本法系采用显色底物法（或显色基质法）测定供试品中激

肽释放酶原激活剂（P KA )含量。

试剂 （1) 0. 0 5m o l/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-

HC1)缓冲液(含0. 15mol/L氯化钠溶液，简称TNB) 称取

6 .06g三羟甲基氨基甲烷（T ris，分子量为121.14)及8. 77g

氯化钠，加适量水溶解后，用lm o l/L盐酸调p H 值至8 .0，

补加水至1000mlD

(2)2m m ol/L激肽释放酶显色底物（S~2302)溶液称取

S-2302 12. 5mg, 加 10ml 水溶解。

(3 )前激肽释放酶（P K ) 采用适宜方法提纯P K , 小体

积分装，_3(TC以下保存备用。

PKA标准品溶液的制备取P K A 标准品适量，用

0. 85%氣化钠溶液分别稀释成每lm l中含10. OIU. 20. 0 IU、

30.0IU、40.0IU、5 0 .0 IU的溶液。按每次用量，小体积分

装，一3 0 t；保存备用。用前融化（仅允许冻融1 次），并用

TN B稀释10倍。

供试品溶液的制备取供试品适量，用T N B 稀释

10倍。

测定法取供试品溶液20^1，加至9 6孔微量滴定板孔

内，加PK 20.50^1，同时开动秒表计时，向每孔加P K 的

时间间隔应相同，将微孔滴定板振荡1分钟；加盖，于25.

30t；放置30分钟后，按加P K 的顺序和时间间隔向各反应

孔加2mmol/L S-2302溶液2 0 j J ,振荡1 分钟；加盖，于

25.30aC放置1 5分钟后，再以同样的加液顺序和时间间隔

加50%醋酸溶液2 0 f J ,振荡1 分钟后，照紫外-可见分光光

度法（通则0401)，在波长405nm处测定吸光度；同时以

TNB20.50F1代替PK 20.50卜1，同法操作，作为空白对

照，用P K A 标准品溶液的2 (^1替代供试品溶液，同法操

作。以P K A 标准品溶液的P K A活性的对数对其相应的吸

光度对数作直线回归，求得直线回归方程，计算出供试品

P K A 活性。

【附注】（1 )每个P K A标准品溶液和供试品溶液做3孔，

其中2 个为测定孔、1 个为对照孔，2 个测定孔吸光度差值

应小于0. 020。

(2 )每次测定可根据供试品P K A含量，适当调整PKA

标准品溶液的范围。

(3 )线性回归的相关系数应不低于0. 99。

(4 )加PK、士2302及50%醋酸溶液时，各孔的间隔时

间应相同，加液的顺序要一致，尽可能使各孔处于同一反应

条件下。

(5 )加P K和加S~2302溶液后的放置时间系从*孔加

液时算起。

(6 )如放置温度低于251C, 应分别在两次反应过程的限

定时间内于3 7 t：放置10分钟。