1 试验方法分析

1.1 试验原理 双乙酰测定的原理是采用水蒸气蒸馏, 使双乙酰作为挥 发性组份从啤酒样中蒸发出来, 然后加入试剂邻苯二胺, 反应 生成 2 ,3 - 二甲基喹喔啉。在波长 335nm 处有一吸收峰, 可作 定量测定。由于邻苯二胺和 2 ,3 - 戊二酮等均有此反应, 因 此, 本法测得的为联二酮的总量(以双乙酰表示)。另外, 如样品 中含有双乙酰甲基甲醇, 也会在蒸馏过程中分解生成双乙酰, 使测定结果偏高[2] 。

1.2 试验仪器 1.2.1 带有加热套管的双乙酰蒸馏器; 

1.2.2 具有锥形瓶(或平底蒸馏烧瓶)的蒸汽发生瓶: 2000mL(或 3000mL); 

1.2.3 容量瓶: 棕色 25mL( 避光) ;

1.2.4 紫外分光光度计: 备有 10mm、20mm、30mm 的石英比色 皿或玻璃比色皿。

1.3 试剂和溶液 1.3.1( 4mol/L) 盐酸溶液: 按 GB/T 601 配制;1.3.2( l0g/L) 邻苯二胺溶液: 称取邻苯二胺 0.100g, 溶于 4mol/L 盐酸溶液中, 并定容 至 10mL, 摇匀, 放于暗处。此溶液须当天配制与使用; 若配制 出来的溶液呈红色, 应重新更换新试剂;

1.3.3 有机硅消泡剂(或甘油聚醚)。

1.4 试验步骤

1.4.1 蒸馏 将双乙酰蒸馏器安装好, 加热蒸汽发生瓶, 使水至沸。通 汽预热后, 置 25mL 容量瓶于冷凝器出口接受馏出液, 外加冰 浴冷却; 加 3 滴消泡剂于 100mL 量筒中, 再注入未经除气的 预先冷至 5℃左右的酒样 100mL, 迅速移入已预热的蒸馏器 内, 并用少量水冲洗量筒及带塞漏斗, 盖塞。然后用水封口, 进 行蒸馏, 直至馏出液接近 25mL(蒸馏需在 3～5min 内完成)时 取下容量瓶, 达到室温用水定容, 摇匀。

1.4.2 显色与测量 分别吸取馏出液 10.0mL 于两支干燥的比色管中, 并于第 一支管中加入邻苯二胺溶液 0.5mL, 第二支管中不加 (做空 白), 充分摇匀后, 同时置于暗处放置 20～30min, 然后于 支管中加 4mol/L 盐酸溶液 2mL, 于第二支管中加入 4mol/L 盐 酸溶液 2.5mL, 混匀后, 于 335nm 波长下, 用 20mm 石英比色 皿, 以空白调仪器零点, 测定其吸光度。( 比色测定操作须在 20min 内完成, 有条件的此过程好在暗室中进行)

1.5 计算结果 试样中双乙酰含量按下式计算:式中: X - 试样中双乙酰的含量, mg/L; A335 - 试样在 335nm 波长下, 用 20mm 比色皿测得的吸 光度; 1.2- 使用 20mm 石英比色皿时, 吸光度与双乙酰含量的 换算系数。 

2 测定结果与讨论

2.1 方法精密度的考察 通过对啤酒样品的多次测定( n=6) , 按照公式( 2) 、( 3) 计 算方法的相对偏差和变异系数, 考察方法的精密度, 并将方法 改进前后两组测定结果列于表 1、表 2。

2.2 讨论 2.2.1 测定误差 众 所 周 知 , 分 光 光 度 计 比 较 适 宜 的 吸 光 度 范 围 是 A = 0.2~0.8。但在此法测定双乙酰含量时, 吸光度的值是很小 的, 所以这是造成测定误差较大的主要原因。因为在正常的工 作环境下, 对于一个给定的分光光度计来说, 透光率读数误差 △T 是一个常数, 约为 0.01~0.02。而透光率 T 与吸光度 A 之 间是对数关系, 同样大小的△T, 在不同的 A 值时所引起的吸 光度的误差△A 是不相同的。由以下推导可以看出, A 值愈 大, △T 引起的△A 愈大。( 以下△T、△A、△X 均为偏差) A = log 1/T = - log T

(4) 由于 A = KX(比耳定律)

(5) △A = K △X

(6) 所以△A/ A = △X/ X

(7) 因此, 当 X 很低时, A 值很小, 这时△T 引起的△A 和△X 也很小, 但因为此时 X 很小, 所以相对偏差△X/ X 是比较大 的。 设双乙酰含量为国标(优级)的上限 0.13mg/ L , 按式(1)计 算, 相应的吸光度 A = 0.13/1.2 = 0.108 由 A = - log T 得出 T = 0.78 若△T = 0.01 则△A = 0.006 相对偏差△X/ X = △A/A = 0.006/ 0.108 = 5.4 % 事实上, 大多数企业为控制成品啤酒双乙酰的回升现象, 双乙酰内控指标是很低的, 一般控制在 0.05mg/ L 左右, 这时, 相应的吸光度 A = 0.042 若△T = 0.01 则△A = 0.005 相对偏差△X/ X = △A/A = 0.005/ 0.042 = 11.9 % 由此可见, 双乙酰测定结果的精密度较差, 可靠程度较 小, 这样势必会造成同一样品平行测定结果的重现性差, 不同 实验室的测定结果就更难比较了。

2.2.2 其他因素对测定结果的影响 双乙酰测定结果往往比实际偏高, 这主要是由于在酵母 形成双乙酰的过程中, 生成一种叫 α- 乙酰乳酸的物质, 这种 物质极不稳定能较快地被氧化成为双乙酰, 也更易干扰双乙 酰的测定, 在啤酒发酵中似乎未检出这种物质, 它也可能是造 成双乙酰测定偏差的主要原因[3,4] 。

2.2.2.1 取样 取样前酒样释放的量要适量, 取样要准确, 在取样的同 时, 样品内存在酵母和空气以及温度上升和时间的延长, 都可 能直接引起双乙酰迅速变化, 所以, 我们用紫外分光光度计法 测定酒样或半成品酒样在取样的时候, 要尽量多放一些酒样, 把瓶颈口或管道中酵母杂质冲下去, 这样取来的酒样才能较 为均匀, 有代表性, 双乙酰测定的数值才能准确[5] 。

2.2.2.2 消泡剂 根据实际测量, 加不加消泡剂对测定值影响很大。若加入 消泡剂, 则所测双乙酰值会明显增大, 这可能是消泡剂同时有 促进双乙酰前体物质转化为双乙酰的作用。

2.2.2.3 蒸馏 在倒入酒样进行蒸馏的时候, 蒸馏要迅速, 要在 3min 内 蒸完。同一样品随蒸馏时间的延长, 其测定结果随之升高。这 主要与样品中存在联二酮类的前驱物质有关。在实际操作中 常由于电炉功率大小、冷却效果的好坏存在差异, 使实际蒸馏 时间发生波动。当高温时, α- 乙酰乳酸的非酶氧化速度很快, 时间不同, 它的转化率也不相同, 造成了前驱物质存在数 量不等的转化, 这在半成品的测定时尤为突出[6] 。 而且, 酒样在存放中时间过长、蒸发器温度过高, 也会引 起双乙酰挥发。蒸馏时有间隔, 使空气进入蒸馏器中, 酒样接 触空气中的氧, 也影响测定数据的准确性。

2.2.2.4 显色剂 显色剂邻苯二胺是显色反应的关键, 此药一定要在暗处 保存, 且不能超期存放, 否则, 试剂的颜色会变得发黄、发黑, 配制出的标准试剂会带有颜色, 使测定结果偏高。所以配制此 药时一定要精心, 且当天配制, 当天使用。显色剂邻苯二胺加 量以 0.5mL 为宜, 暗处反应时间可控制在 15～25min。

2.2.2.5 显色温度 显色反应速度与温度有关。实验表明, 随着显色温度升 高, 反应速度加快, 其颜色逐步加深, 吸光度增加, 会使测定 结果偏高; 温度过低, 反应不充分, 则会使测定结果偏低。这可 能同参与显色的物质成份有关。由于不同的环境、不同的季节 温度悬殊较大, 所以测定结果会有误差。但国标中未对测定时 的显色温度作出规定。

2.2.2.6 比色皿 双乙酰的测定选用波长为 335nm, 属紫敏光源, 按仪器使 用说明书, 在此波长下进行比色一定要使用石英比色皿, 若使 用玻比色皿会使测定结果偏高。国标中未对比色皿的材质做 出明确规定, 一些化验室使用玻璃比色皿也可能造成一定的 误差。

3 提高测定结果准确度的建议 , 为使测定结果得到较高的准确度, 应经常校正分光 光度计的灵敏度和波长精度, 并尽量控制被测溶液的吸光度 接近于 0.2~0.8 的范围。为此, 建议测定时使用 30mm 的石英 比色皿。( 这时的双乙酰含量按下式计算: X=A335×0.8。) 第二, 为了满足反应要求, 要尽可能的选择理想的测定方 法, 取样要准确。取样前酒样释放的容量要适量, 酒样存放的 时间要短, 蒸馏要迅速, 并控制蒸馏时间在 3min 之内, 酒样接 触空气中氧的时间要尽量缩短, 得到 25mL 馏出液即可, 否则 测定结果偏高。 第三, 根据试验结果, 蒸馏啤酒中双乙酰时收集温度以在 室温以下直接收集为宜。加不加消泡剂对测定值影响很大, 若 加入消泡剂, 则所测双乙酰值会明显增大。 第四, 严格按要求配制显色剂等标准溶液。鉴于显色温度 对测定结果会产生一定的影响, 建议将显色温度统一规定为 20℃(或 25℃)。显色剂邻苯二胺加量以 0.5mL 为宜, 暗处反应 时间可控制在 15～25min。 后, 仪器使用要正确, 操作要准确熟练。尽量减少各种 操作误差, 保证双乙酰测定的准确度 。